Ang patuloy na pagsalakay ng mananakop ng Espanya na si Don Nuño Beltrán de Guzmán patungo sa kanlurang mga lupain ng bansa, upang madagdagan ang kanyang kapangyarihan at kapangyarihan sa mga teritoryong iyon, nagresulta sa pagkakaroon ng isang bagong lalawigan na tinawag na Kaharian ng New Galicia.
Ang rehiyon ay tinitirhan ng iba't ibang mga katutubong grupo, na patuloy na sinalanta ang mga pakikipag-ayos na natatagpuan dito ng mga Espanyol. Ang tenyente ni Nuño de Guzmán, si Kapitan Juan B. de Oñate, ay tumanggap ng mga utos na patahimikin ang mga lalawigan na iyon at matagpuan ang Villa de Guadalajara sa lugar na tinawag na Nochistlán, isang katotohanan na natapos noong Enero 5, 1532. Dahil sa madalas na pag-atake ng mga katutubo sa lungsod kailangan niyang lumipat isang taon mamaya sa Tonalá at kalaunan sa Tlacotlán. Ang isang pangatlong paglipat ay ginawa upang manirahan sa bayan sa Atemajac Valley, kung saan ang lungsod ay tiyak na itinatag noong Pebrero 14, 1542 na may presensya ni Cristóbal de Oñate bilang gobernador ng Nueva Galicia at Don Antonio de Mendoza, pagkatapos ay viceroy ng New Spain, na humirang kay Miguel de Ibarra bilang alkalde at tenyente gobernador.
Mabilis na umunlad ang lungsod at nagsimulang makipagkumpitensya sa Compostela (ngayon Tepic), na noon ay ang upuan ng mga kapangyarihang pang-relihiyon at sibil, kung kaya't ang mga naninirahan sa Guadalajara ay nagbigay ng gayong pagpipilit sa mga awtoridad ng Audiencia, na ang hari Nagpasya si Felipe II na mag-isyu ng isang Sertipiko na may petsang Mayo 10, 1560 upang siya ay lumipat mula sa Compostela patungong Guadalajara, ang Cathedral, ang Royal Court at ang mga opisyal ng Treasury.
Ang istraktura ng lunsod ay pinlano ayon sa ibang mga kolonyal na lungsod, kaya ang layout nito ay binuo sa anyo ng isang chessboard mula sa kung ano ang plasa ng San Fernando. Nang maglaon ang mga kapitbahayan ng Mexicaltzingo at Analco ay itinatag ni Fray Antonio de Segovia, at ang kapitbahayan ng Mezquitán, isa sa pinakamatanda. Ang mga bahay ng hall hall ay itinayo din, sa tapat ng kasalukuyang templo ng San Agustín at ang unang simbahan ng parokya kung saan matatagpuan ang Palace of Justice.
Ngayon, ang kamangha-manghang lungsod, masagana sa mga kolonyal na gusali, ay nagpapakita ng maraming bilang ng mga nauugnay na halimbawa ng arkitektura, tulad ng Cathedral nito, isang dapat makita na site, na itinayo sa pagitan ng 1561 at 1618 ng arkitekto na si Martín Casillas. Ang kanyang istilo ay inuri bilang incipient baroque. Ang solidong istraktura nito ay tumataas sa harap ng ngayon na Plaza de Guadalajara, kasama ang mga nagtataka na moog na, kahit na hindi sila kabilang sa orihinal na istilo ng gusali, kasalukuyang kinikilala bilang isang simbolo ng kapital ng Guadalajara. Ang mga primitive tower ay nawasak noong ika-19 na siglo ng isang lindol, kaya't idinagdag ang mayroon nito ngayon. Ang loob ng templo ay nasa istilong semi-Gothic, kasama ang mga vault nito na gawa sa puntas.
Ang iba pang mga relihiyosong lugar mula noong ika-16 na siglo ay ang kumbento ng San Francisco, na itinatag noong 1542 malapit sa ilog, sa kapitbahayan ng Analco, at halos ganap na nawasak sa Repormasyon. Ang templo nito, naayos sa katapusan ng ika-17 siglo, na may baroque façade ng katamtamang mga linya ng Solomon, ay napanatili. Ang kumbento ng San Agustín, ay itinatag noong 1573 ng Royal Ordinance ng Felipe II at kasalukuyang pinangangalagaan ang templo nito na may harapan ng malubhang mga linya ng Herrerian at ang loob nito na may ribed vault.
Si Santa María de Gracia, isa pa sa mga pundasyon ng kumbento, ay sinakop ng mga madre na Dominican mula sa Puebla, na itinayo noong 1590 sa harap ng Plaza de San Agustín at binayaran ni Hernán Gómez de la Peña. Ang konstruksyon ay sumakop sa anim na bloke, bagaman ngayon ang templo lamang nito ang nagpapatuloy, na may isang neoclassical na harapan mula sa ikalawang kalahati ng ika-18 siglo.
